Regulacja metabolizmu. Zbiór ćwiczeń UW [2010].pdf

(399 KB) Pobierz
REGULACJA METABOLIZMU
Zbiór ćwiczeń dla studentów III roku kierunku Biologia
oraz studentów I roku MU na kierunku Biologia (spec. BKiO)
i na kierunku Biotechnologia (spec. Biol.Mol., Biotech. lub Biot.Med.)
Zakład Regulacji Metabolizmu
Instytut Biochemii UW
Spis treści
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Aktywność glikolityczna w homogenacie mózgu
Transport anionów przez błonę mitochondrialną
Metabolizm glikogenu w homogenacie wątroby
Metabolizm argininy w mitochondriach
Karboksylacja pirogronianu w mitochondriach wątroby
Wpływ różnych efektorów na aktywność dehydrogenazy
glutaminianowej w mitochondriach wątroby lub nerki
str. 3
str. 7
str.10
str.13
str.16
str.20
Oznaczanie fosforu metodą Fiske-Subbarowa
Oznaczanie białka metodą biuretową
str.23
str.24
2
1. AKTYWNOŚĆ GLIKOLITYCZNA W HOMOGENACIE MÓZGU
Glikoliza w tkankach zwierzęcych polega na przekształceniu glukozy w mleczan w
procesie obejmującym szereg reakcji enzymatycznych, czemu towarzyszy wytworzenie 2
moli ATP na jeden mol zużytej glukozy. Aktywność glikolityczna jest uwarunkowana
obecnością ATP i NAD
+
. ATP jest niezbędny do fosforylacji glukozy i fruktozo-6-fosforanu
w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę. NAD
+
jest koenzymem
dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego.
Oznaczenie aktywności glikolitycznej polega na pomiarze ubytku glukozy i fosforanu
z mieszaniny reakcyjnej, oraz na oznaczeniu wytworzonego mleczanu. Stężenie glukozy
oznacza się kolorymetrycznie mierząc produkt jej reakcji z kwasem dinitrosalicylowym.
Fosforan oznacza się metodą Fiske-Subbarowa (patrz. odp. rozdział), a obecność mleczanu w
mieszaninie reakcyjnej wykrywa się spektrofotometrycznie na podstawie redukcji NAD
+
w
reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową.
Materiały i odczynniki
1. Homogenat mózgu: mózg szczura lub królika homogenizować przez 20 s w czterokrotnej
objętości zimnego, 1 mM buforu osforanowego o pH 7,4. Homogenat przygotować
bezpośrednio przed rozpoczęciem inkubacji i przechowywać w łaźni lodowej.
2. 50 mM glukoza
3. 0,2 M bufor fosforanowy
(zrobiony, 4
0
C)
4. 0,1 M amid kwasu nikotynowego
5. Mieszanina podstawowa o składzie: 25 mM glukozy, 15 mM bufor fosforanowy, 25 mM
amid kwasu nikotynowego. Do kolbki miarowej odmierzyć odpowiednie ilości odczynników:
2, 3 ,4 i uzupełnić wodą do 25 ml.
6. 80 mM M MgCl
2
(zrobiony, 4
0
C )
7. 5 mM NAD
+
8. 7 mM zobojętniony ATP
(zrobiony, -20
0
C )
9. 0,25 M KHCO
3
(zrobiony, RT)
10. 35 % kwas nadchlorowy (PCA)
(zrobiony, RT)
11. 3 M K
2
CO
3
(zrobiony, RT)
12. 5 M KOH
(zrobiony, pod wyciągiem)
13. Odczynniki do oznaczania fosforu (patrz rozdział „Oznaczanie fosforu”)
3
14. Standardowy roztwór glukozy (2 mg/ml)
15. 1 % roztwór dinitrosalicylowego w 0,4 M NaOH.
(zrobiony, RT)
16. Bufor do oznaczania mleczanu o składzie: 0,4 M wodzian lub siarczan hydrazyny, 1 M
glicyna, 5 mM EDTA; pH 9.5 (pH doprowadzić za pomocą 5 M KOH - zużywa się go ok. 10
ml !). Należy przygotować 50 ml buforu (w
dniu oznaczania mleczanu !)
17.
18.
Roztwór NAD (60 mg/ ml)
Roztwór dehydrogenazy mleczanowej
(wydaje prowadzący)
Wykonanie
a.
Czynności przygotowawcze
0
Nastawić temperaturę łażni wodnej na 37
probówek;
C. Przygotować 4 serie ponumerowanych
- 3 probówki ok. 10 ml do przeprowadzenia inkubacji
- 9 ponumerowanych od 1 do 9 probówek typu Eppendorf zawierających 0,1 ml 35 % PCA -
9 probówek ok. 10 ml do zobojętniania prób
- 9 probówek typu Eppendorf do przechowywania prób.
b.
Przeprowadzenie inkubacji
Do 3 ponumerowanych probówek odmierzyć poszczególnie składniki mieszaniny reakcyjnej
wg. Tabeli (objętości podano w ml)
Składniki
1
Mieszanina podstawowa
Woda
MgCl
2
NAD
ATP
KHCO
3
1,6
-
0,4
0,4
0,4
0,4
Numer probówki
2
1,6
0,4
0,4
-
0,4
0,4
3
1,6
0,4
0,4
0,4
-
0,4
Uwaga, do pipetowania homogenatu używać końcówek do pipet skróconych skalpelem o ok. 2
mm. Przed rozpoczęciem reakcji mieszaniny reakcyjne inkubować w 37
0
C co najmniej 3 min.
4
Homogenat mózgu zamieszać. Reakcje rozpocząć dodaniem dokładnie 0,8 ml homogenatu do
probówki nr 1. Właczyć stoper, zamieszać zawartość probówki i szybko pobrać 1 ml
mieszaniny, przenieść ją do probówki Eppendorfa nr 1 zawierającej PCA. Probówkę nr 1 z
mieszaniną reakcyjną ponownie umieścić w łażni. Po 1 min dodać 0,8 ml homogenatu do
probówki nr 2 i jak poprzednio, po wymieszaniu, pobrać 1 ml do odpowiedniej probówki
Eppendorfa. Po upływie kolejnej minuty rozpocząć reakcję w probówce nr 3, pobierając
również i z niej próbę odpowiadającą czasowi „0 min”.
Po inkubacji z probówek 1, 2 ,3 pobrać w odstępach 1 min po 1 ml i przenieść do probówek
Eppendorfa (4, 5, 6) zawierających PCA. Czas „30 min” pobrać odpowiednio do probówek
Eppendorfa nr (7, 8, 9). W ten sposób otrzymuje się próby do oznaczania fosforu, glukozy, i
mleczanu odpowiadające 0, 15, 30 min inkubacji.
c.
Przygotowanie prób do oznaczania
Próby zawierające wytrącone białko należy odwirować w mikrowirówce przez 2 min.
Supernatanty przenieść do odpowiednich probówek, a następnie zawartość każdej z nich
zobojętnić za pomocą 3 M węglanu potasowego. Wartość pH należy kontrolować za pomocą
papierka lakmusowego. Zanotować objętość roztworu węglanu zużytą do zobojętniania
każdej próby (do zobojętniania 1 ml supernatantu zużywa się około 91 µl węglanu). Po
zobojętnieniu próby należy przenieść do próbówek typu Eppendorf i wstawić na 12-15 min
do zamrażalnika, a następnie osad nadchloranu zwirować. Suprnatant przenieść do
odpowiednich probówek Eppendorfa. Próby przechowujemy zamrożone.
d.
Oznaczanie glukozy
Jednocześnie z oznaczaniem glukozy w badanych próbach należy wykonać krzywą
wzorcową. Do probówek na typu Eppendorf należy odmierzyć w dwóch powtórzeniach
odpowiednie objętości roztworu wzorcowego tak, by zawierały 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 lub 0,8 mg
glukozy. Objętość roztworu w każdej probówce należy dopełnić wodą destylowaną do 1 ml, a
następnie dodać 0,175 ml 1% roztworu kwasu dinitrosalicylowego w 0,4 M NAOH.
Z badanych prób pobrać po 0,15 ml roztworu i przenieść do ponumerowanych próbówek. Do
każdej próbówki dodać 0,85 ml wody destylowanej , a następnie 0,175 ml roztworu kwasu
dinitrosalicylowego. Zawartość wszytykich probówek wymieszać i wstawić je do termobloku
na 100
0
C na 10 min. Po wyjęciu probówki ostudzić i zmierzyć absorpcję prób przy 550 nm
wobec próby odczynnikowej (bez glukozy).
5

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin