Enzymologia II. Materiały do ćwiczeń skrypt UW [2016].pdf

(1570 KB) Pobierz
Warszawa, listopad 2016
ENZYMOLOGIA II
Materiay do
wicze�½
opracowa zespó Zakadu Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii Wydziau Biologii UW
wiczenia
s przeznaczone dla studentów Wydziau Biologii, Chemii, MISMaP
oraz innych kierunków przyrodniczych
Zestaw zada�½
1. Wyznaczanie staej Michaelisa i szybkoci maksymalnej dla dehydrogenazy L-
mleczanowej
2. Otrzymywanie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z drożdży piwnych.
Sporzdzenie bilansu oczyszczania biaka enzymatycznego
3. Oznaczanie aktywności wieloenzymowego układu fotosyntetycznego
4. Symulacja reakcji enzymatycznych w programie Gepasi. Wyznaczanie
parametrów kinetycznych na podstawie zebranych danych
strona
2
11
22
29
1
I. WYZNACZANIE STAEJ MICHAELISA I SZYBKOCI MAKSYMALNEJ DLA
DEHYDROGENAZY L-MLECZANOWEJ
W czasie trwania każdej reakcji enzymatycznej można wyróżnić trzy fazy (Rys. 1.1). Pierwsza z nich, faza
prestacjonarna (I) trwa kilka milisekund i rozpoczyna się z chwilą dodania enzymu do mieszaniny
inkubacyjnej. Następuje wtedy szybkie tworzenie kompleksu enzym-substrat ES i spadek stężenia wolnego
enzymu E. Druga faza, stacjonarna (II) trwa wystarczająco długo, aby możliwy był pomiar szybkości reakcji
metodami powszechnie stosowanymi w laboratoriach biochemicznych. Charakterystyczne cechy fazy
stacjonarnej to stała szybkość reakcji, stałe stężenie kompleku ES i enzymu E. Gdy stężenie substratu obniży
się na tyle, że zacznie obniżać się stężenie kompleku ES i spada szybkość reakcji, zaczyna się trzecia,
poststacjonarna (III) faza reakcji.
Rys. 1.1.
Zmiany stężenia substratu [S], produktu [P], wolnego enzymu [E] i kompleksu enzym-
substrat [ES] w czasie trwania jednosubstratowej reakcji enzymatycznej.
Fazy reakcji enzymatycznej: I - prestacjonarna, II - stacjonarna, III - poststacjonarna.
Założenia teorii Briggsa-Haldena, rozszerzającej postulaty Michaelisa i Menten, dotyczą właśnie fazy
stacjonarnej reakcji enzymatycznej. W fazie stacjonarnej przyrostowi stężenia produktu towarzyszy
równomolowy spadek stężenia substratu a szybkość reakcji zależy od stężenia kompleksu ES (wzór *), gdzie
[S] i [ES] oznacza stężenia substratu i kompleksu enzym-substrat a k
+2
jest stałą rozpadu kompleksu ES.
W czasie trwania fazy stacjonarnej ustala się stan równowagi dynamicznej rozpadu i tworzenia kompleksu ES
2
(wzór **).
*
���� =
−����[����]
= ����
+2
[��������]
��������
**
����[��������]
≈0
��������
Równanie kinetyczne reakcji chemicznej można przedstawić jako zależność opisującą szybkość reakcji od
zmian stężenia reaktantów. Równanie Michaelisa-Menten oparte jest na tej zasadzie opisu procesów
kinetycznych. Wyznaczenie stałych kinetycznych wymaga zmierzenia, w fazie stacjonarnej reakcji,
początkowych szybkości reakcji enzymatycznej (V
0
) przy znanych wartościach początkowych stężeń substratu
([S
0
]).
Szybkość maksymalną reakcji
V
max
i stałą Michaelisa
K
m
wyznacza się przy użyciu metod przekształcających
równanie Michaelisa-Menten (I) z zależności hiperbolicznej w prostoliniową. Najczęściej stosowana jest
metoda Lineweavera-Burke'a, gdzie zastosowano odwrotność równania podstawowego (II). Istnieje wiele
przekształceń równania Michaelisa-Menten umożliwiających proste graficzne wyznaczenie stałych
kinetycznych np. metoda Hofstee-Eadie'go (III), czy metoda Hanesa (IV). Dokładne wyznaczenie stałej
Michaelisa (K
m
) i szybkości maksymalnej (V
max
) na podstawie początkowych szybkości reakcji (V
0
) i
początkowych stężeń substratu ([S
0
]) umożliwia metoda Eisenthala i Cornish-Bowdena (V). W tej metodzie
należy wykreślić proste łączące wartości szybkości początkowych (V
0
) odłożone na dodatniej osi 0Y z
wartościami początkowych stężeń substratu [S
0
] odłożonych na ujemnej osi 0X. Współrzędne punktu ich
przecięcia to wartości
V
max
(oś 0Y) i
K
m
(oś 0X).
(I)
����
0
=
���� [����
0
]
������������
[����
0
] + ����
����
3
(II)
1
1
����
����
=
+
����
0
����
���� [����
0
]
������������
max⁡
(III)
����
0
= ����
������������
− ����
����
����
0
[����
0
]
(IV)
[����
0
]
����
����
[����
0
]
=
+
����
0
����
����
������������
������������
(V)
����
������������
= ����
0
+
����
0
����
[����
0
]
����
4
Równanie kinetyczne reakcji chemicznej można także przedstawić jako zależność opisującą zmiany stężenia
reaktantów w czasie. Jednym ze sposobów analizy kinetycznej całej krzywej przebiegu reakcji enzymatycznej
są metody posługujące się scałkowaną w przedziale czasowym [t
0
=0, t] postacią równania szybkości reakcji
enzymatycznej, tak jak zaproponowana przez Walkera i Schmidta:
[����
0
]
[����
0
]−[����]
(VI)
����
����
= [����] + ����
����
��������
gdzie [P] to stężenie produktu w czasie t, zaś [S
0
] to początkowe stężenie substratu. Wzór (VI) można łatwo
przekształcić do postaci (VII) umożliwiającej łatwe wyznaczenie wartości
K
m
i
V
max
:
(VII)
����
1 [����
0
] − [����]
����
����
=
+
[���� ] ����
����
������������
�������� [����
0
]
������������
��������
0
[����]
[����]
Uywana
w
dowiadczeniu
dehydrogenaza
L-mleczanowa
(EC1.1.1.27)
(http://www.expasy.ch/enzyme/1.1.1.27) jest jednym z enzymów glikolizy katalizujcym reakcj:
CH3
│
H─C─OH + NAD
+
│
COOH
CH3
│
C═O + NADH + H
+
│
COOH
Materiay i odczynniki
(sporzdzi na wodzie dejonizowanej o przewodnioci nie wikszej ni 3 μS)
1. 0,07 M potasowy bufor fosforanowy pH 6,6. Przygotowa 100 ml buforu.
2. 3,2 M roztwór siarczanu amonowego.
3. 20 mM roztwór pirogronianu sodu. Przygotowa 10 ml roztworu. Oznaczy dokadnie stenie roztworu
pirogronianu sodu metod enzymatyczn (patrz
Wykonanie).
5

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin