Enzymologia I. Materiały do ćwiczeń skrypt UW [2014].pdf

(1280 KB) Pobierz
Warszawa, luty 2014
Enzymologia I
Materiały do
ćwiczeń
dla studentów kierunku Biotechnologia
Wydziału Biologii UW
oraz dla wszystkich zainteresowanych studentów kierunków przyrodniczych
opracował zespół Zakładu Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii
Wydziału Biologii
Ćwiczenie
1
Oznaczenia enzymatyczne w diagnostyce medycznej
Oznaczanie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika
Aminotransferaza alaninowa (AlaT; transaminaza glutaminian:pirogronian = GPT; EC 2.6.1.2) oraz
aminotransferaza asparaginianowa (AspT; transaminaza glutaminian:szczawiooctan = GOT; EC 2.6.1.1) są
enzymami uczestniczącymi w metabolizmie aminokwasów. Szczególnie duŜą aktywnością tych enzymów
charakteryzują się: wątroba, serce, mózg i mięśnie szkieletowe. U zdrowego człowieka aktywność
aminotransferaz w osoczu jest znikoma, a jej wzrost niemal zawsze wskazuje na uszkodzenie któregoś z
wymienionych narządów. Wysoką aktywność aminotransferaz stwierdza się m.in. u chorych z zawałem
serca (głównie AspT), wirusowym zapaleniem wątroby (głównie AlaT), marskością lub nowotworem
wątroby oraz dystrofią mięśniową. Pomiar aktywności aminotransferaz w osoczu jest zatem rutynowo
wykorzystywany w diagnostyce medycznej. W warunkach normy aktywność aminotransferaz powinna
zawierać się w granicach 8–38 jednostek l
–1
surowicy krwi.
Zasada pomiaru aktywności aminotransferaz
Aminotransferaza alaninowa (AlaT) katalizuje reakcję:
L-Alanina + 2-Oksoglutaran
↔
Pirogronian + L-Glutaminian
(1)
Aktywność enzymu jest określana szybkością przyrostu stęŜenia produktu reakcji – pirogronianu. Zawartość
tego związku moŜna oznaczyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340 nm na podstawie spadku
stęŜenia NADH, który jest zuŜywany podczas katalizowanego przez dehydrogenazę mleczanową
przekształcenia pirogronianu w mleczan:
+
Pirogronian + NADH
↔
Mleczan + NAD
(2)
Obie reakcje są prowadzone równolegle w tej samej kuwecie, co pozwala na bieŜąco
śledzić
szybkość
reakcji katalizowanej przez aminotransferazę alaninową.
Aktywność aminotransferazy asparaginianowej (AspT) jest oznaczana w analogiczny sposób. Enzym ten
katalizuje reakcję:
L-Asparaginian + 2-Oksoglutaran
↔
Szczawiooctan + L-Glutaminian
(1)
StęŜenie produktu tej reakcji – szczawiooctanu moŜna mierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340
nm na podstawie spadku stęŜenia NADH w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę jabłczanową:
Szczawiooctan + NADH
↔
Jabłczan + NAD
+
(2)
Celem
ćwiczenia
jest oznaczenie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika.
1
Wykonanie
Materiały i odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
do oznaczania aminotransferazy alaninowej, AlaT
0,4 M bufor fosforanowy pH 7,4 (10 ml)
1 M roztwór L-alaniny (2,5 ml)
Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,2 M L-alanina
(10 ml)
0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 µl)
NawaŜka NADH słuŜąca do sporządzenia roztworu o stęŜeniu 10 mg ml
–1
(100 µl)
Dehydrogenaza mleczanowa
do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej, AspT
0,4 M bufor fosforanowy pH 7,6 (10 ml)
2 M roztwór L-asparaginianu (5 ml)
Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,5 M L-
asparaginian (10 ml)
0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 µl)
NawaŜka NADH słuŜąca do sporządzenia roztworu o stęŜeniu 10 mg ml
–1
(100 µl)
Dehydrogenaza jabłczanowa
7.
8.
9.
10.
11.
12.
A.
Przygotowanie surowicy do oznaczeń
ŚwieŜo
pobraną krew umieścić na ok. 2 godziny w cieplarce nastawionej na 37°C, celem wytworzenia
skrzepu.
śółtawą
ciecz znad skrzepu odwirować i tak otrzymany preparat wykorzystywać do oznaczeń.
Studenci otrzymują gotowy preparat surowicy
B.
Pomiar aktywności aminotransferaz
Pomiary oznaczyć następująco: oznaczanie aktywności
AlaT
– próby Nr 1, 2, 3;
oznaczanie
aktywności
AspT
– próby 4, 5, 6.
Korzystając ze stęŜonych roztworów (odpowiednio: odczynniki nr 1 i nr 2 lub odczynniki nr 7 i nr 8),
przygotować 10 ml mieszaniny podstawowej potrzebnej do pomiaru aktywności wybranej aminotransferazy
(odczynnik nr 3 lub nr 9). Na 15 min przed pomiarem włączyć spekol. Ustawić długość fali 340 nm. Pomiar
prowadzić w temperaturze pokojowej.
Do kuwety odmierzyć: 500 µl odpowiedniej mieszaniny podstawowej, 15 µl NADH, odpowiednią
dehydrogenazę (5 µl enzymu rozcieńczonego według wskazówek prowadzących) oraz 25 µl surowicy.
Zawartość kuwety uzupełnić wodą do takiej objętości, aby w chwili rozpoczęcia reakcji, czyli po dodaniu 30
µl 2-oksoglutaranu, całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 1 ml. Następnie wymieszać i
preinkubować przez 5 min. Następnie zmierzyć absorbancję wobec wody jako próby odniesienia. Rozpocząć
reakcję dodaniem 30 µl 2-oksoglutaranu. W momencie dodania 2-oksoglutaranu uruchomić pomiar czasu i
odczytywać zmiany absorbancji co 15 sekund przez ok. 5 min. Objętość próby badanej (surowicy) jest
dobrana prawidłowo, jeśli zmiany absorbancji w ciągu 15 s wynoszą około 0,020–0,030 jednostek
absorbancji. Jeśli otrzymane wyniki odbiegają od tej wartości, powtórzyć pomiar, odpowiednio zmiejszając
lub zwiększając rozcieńczenie surowicy. Jeśli otrzymany wynik jest zgodny z oczekiwaniami, wykonać
jeszcze dwa powtórzenia, stosując tę samą objętość surowicy.
C.
Opracowanie wyników
Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.
Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie naleŜy odłoŜyć na wykresach (dobierając
odpowiednio skalę na osi rzędnych) i wyliczyć szybkość początkową reakcji
V
0
=
∆
absorbancji min
–1
.
Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą w kuwecie i wyrazić w µmolach min
–1
, wiedząc,
Ŝe
milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy 340 nm wynosi
ε
= 6,22 mM
–1
cm
–1
.
Podać
aktywność transaminaz w 1 ml surowicy krwi królika. Wyniki zestawić w tabeli, na koniec obliczając
średnią
aktywność transaminaz w 1l surowicy.
2
Ćwiczenie
2
Wpływ rozpuszczalników organicznych na stabilność enzymów
na przykładzie dehydrogenazy alkoholowej
Zamiana
środowiska
działania enzymów ze
środowiska
wodnego na
środowisko
organiczne ma
szczególne zastosowanie w biotechnologii, np. wtedy gdy substrat(y) łatwiej rozpuszcza(ją) się w
roztworach o niŜszej polarności niŜ woda. W
środowisku
organicznym moŜna teŜ przeprowadzić reakcje
syntez przy uŜyciu hydrolaz, co praktycznie jest niemoŜliwe w
środowisku
wodnym. Przykładem takich
syntez jest produkcja paliwa „biodiesel” z zastosowaniem lipaz katalizujących reakcję transestryfikacji
kwasów tłuszczowych pochodzących z olejów roślinnych w obecności metanolu lub etanolu. Reakcja ta w
środowisku
wodnym nie zachodzi z uwagi na rozpuszczalność substratu oraz na powstający produkt reakcji
– wodę, która będąc jednocześnie rozpuszczalnikiem, przesuwa równowagę reakcji w kierunku hydrolizy.
Do kolejnych zalet
środowiska
organicznego moŜna zaliczyć często zwiększoną termostabilność enzymów
oraz mniejsze niŜ w roztworach wodnych ryzyko zakaŜenia mikroorganizmami. Co więcej, reakcje
wymagające udziału substratów higroskopijnych, takich jak np. bezwodniki kwasowe zachodzą z większą
wydajnością w
środowisku
organicznym. Ponadto modyfikacje polarności rozpuszczalnika wykorzystuje się
czasem w celu kontroli stereospecyficzności enzymów.
Szereg enzymów wykazuje zwiększoną termostabilność w roztworach organicznych. Na przykład
lipaza trzustkowa lub lizozym zachowują stabilność w temperaturze 100°C przez wiele godzin, podczas gdy
tak znaczna trwałość enzymów nie jest moŜliwa w
środowisku
wodnym nawet po ich róŜnego rodzaju
modyfikacjach (np. immobilizacji). Zwiększona termostabilność wynika między innymi z tego,
Ŝe
większość
procesów prowadzących do nieodwracalnej inaktywacji białek, jak np. deamidacja, hydroliza wiązań
peptydowych czy rozszczepianie reszt cystyny wymaga udziału wody. Interesujące jest,
Ŝe
optymalna
temperatura działania mitochondrialnej ATPazy w kierunku hydrolizy ATP jest taka sama (około 58°C)
zarówno w wodzie, jak teŜ roztworze o jej małej zawartości. Natomiast stabilność tego enzymu jest znacznie
większa w
środowisku
mniej polarnym.
Celem
ćwiczenia
jest zbadanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej (EC 1.1.1.1) inkubowanej
przez dwie godziny w
środowisku
wodnym lub organicznym w zakresie temperatur od 25 do 75°C.
Dehydrogenaza alkoholowa katalizuje reakcje utlenienia alkoholu do aldehydu z jednoczesną redukcją
NAD
+
do NADH.
etanol + NAD
↔
aldehyd octowy + NADH
Zmiany stęŜenia NADH w czasie trwania reakcji moŜna oznaczyć, wykorzystując jego zdolność absorbancji
promieniowania elektromagnetycznego o długości fali 340 nm.
+
Wykonanie
Materiały i odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
50 mM bufor fosforanowy o pH 7,8 (30 ml)
Toluen (200 µl)
Dodekan (moŜna zamiast dodekanu uŜyć oktanu) (200 µl)
Dehydrogenaza alkoholowa (liofilizowana)
+
100 mM wodny roztwór NAD (350 µl)
1 M wodny roztwór etanolu (200 µl)
Materiały pomocnicze i aparatura
Liofilizator, zamraŜarka –80°C, spektrofotometr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło
Studenci rozpoczynają
ćwiczenie
od etapu C
3

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin